LL-37: guía práctica

LL-37, el péptido antimicrobiano catelicidina humano, es un péptido catiónico de 37 aminoácidos con aplicaciones amplias en investigación antimicrobiana, inmunología, cicatrización de heridas y biología del cáncer. Esta guía ofrece protocolos prácticos para uso en investigación, basados en metodologías establecidas por la comunidad de investigación de péptidos antimicrobianos.

Obtención y preparación

LL-37 se suministra como péptido liofilizado sintético con la secuencia LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES y un peso molecular de 4.493,33 daltons. El LL-37 de grado investigación está disponible en empresas especializadas en síntesis de péptidos con purezas del 95 por ciento o superiores por HPLC, típicamente en cantidades de 1 mg, 5 mg o 10 mg por vial. El péptido puede suministrarse como sal de trifluoroacetato (TFA) o sal de acetato. Para investigación celular e in vivo, se prefiere la sal de acetato porque el TFA puede causar citotoxicidad a concentraciones más altas de péptido. Si solo está disponible el péptido en sal de TFA, el TFA puede eliminarse mediante liofilización repetida a partir de ácido clorhídrico diluido (HCl 0,1 M) o mediante intercambio aniónico.

Para la reconstitución de LL-37 liofilizado, deje que el vial alcance la temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. LL-37 es soluble en agua, solución salina y soluciones tamponadas, pero su solubilidad y actividad biológica dependen del pH y de la fuerza iónica. Para preparar la solución madre, disuelva LL-37 en agua estéril libre de endotoxinas hasta una concentración de 1 a 5 mg por mL (aproximadamente 220 a 1.110 micromolar). A estas concentraciones, LL-37 puede autoasociarse en estructuras oligoméricas, lo cual es normal y no indica degradación. Para las soluciones de trabajo en ensayos antimicrobianos, diluya la solución madre en el tampón o medio de ensayo apropiado. Importante: LL-37 se adsorbe fácilmente a superficies plásticas y de vidrio, particularmente a bajas concentraciones. Para minimizar las pérdidas por adsorción, use tubos de baja unión a proteínas (polipropileno o siliconizados), prepare soluciones de trabajo a concentraciones superiores a 1 micromolar siempre que sea posible, y añada proteína transportadora (albúmina sérica bovina al 0,01 por ciento) a soluciones muy diluidas. Para fines de inyección, disuelva en agua bacteriostática estéril o solución salina fisiológica estéril. La solución reconstituida debe ser clara. Una ligera opalescencia a altas concentraciones es normal y refleja la asociación oligomérica.

Los protocolos de dosificación para la investigación con LL-37 varían sustancialmente según la aplicación y el sistema modelo. Las siguientes secciones describen protocolos establecidos para las principales categorías de investigación.

Ensayos antimicrobianos y antibiofilm

Para las pruebas antimicrobianas in vitro, la metodología estándar sigue las directrices del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, adaptadas para agentes peptídicos. La determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) utiliza microdilución en caldo en placas de 96 pocillos de polipropileno (no poliestireno, que adsorbe péptidos catiónicos). El caldo Mueller-Hinton es el medio estándar, pero cabe señalar que su contenido de cationes divalentes afecta la actividad de LL-37. Algunos investigadores usan caldo Mueller-Hinton ajustado en cationes (CAMHB) para estandarización. LL-37 se prueba en diluciones seriadas al doble desde 128 mcg por mL hasta 0,25 mcg por mL. Los valores típicos de CMI para LL-37 frente a patógenos comunes son: Escherichia coli, 2 a 16 mcg por mL; Staphylococcus aureus, 16 a 64 mcg por mL; Pseudomonas aeruginosa, 16 a 64 mcg por mL; Candida albicans, 8 a 32 mcg por mL. Para ensayos de cinética de muerte, bacterias en fase logarítmica media (aproximadamente 10 elevado a 6 unidades formadoras de colonias por mL) se exponen a LL-37 a 1x, 2x y 4x la CMI, con muestras tomadas a los 0, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos para determinar el recuento de viables.

Para la investigación antibiofilm, LL-37 es particularmente notable porque inhibe la formación de biopelículas a concentraciones sub-CMI. Los ensayos de prevención de biopelículas usan LL-37 a 0,5 a 16 mcg por mL añadido en el momento de la inoculación bacteriana en placas de 96 pocillos. La masa de biopelícula se cuantifica después de 24 horas mediante tinción con cristal violeta. Para la disrupción de biopelículas ya establecidas, biopelículas maduras de 24 a 48 horas se tratan con LL-37 a 32 a 256 mcg por mL (2x a 16x la CMI) durante 24 horas, evaluando la viabilidad de la biopelícula mediante tinción LIVE/DEAD y microscopía confocal o mediante recuento de colonias de bacterias dispersadas de la biopelícula.

Ensayos inmunomoduladores celulares

Para la investigación inmunomoduladora en cultivo celular, LL-37 se utiliza a concentraciones de 1 a 50 micromolar (aproximadamente 4,5 a 225 mcg por mL) para estudiar sus efectos sobre las células inmunitarias. Los ensayos de quimiotaxis emplean cámaras de Boyden modificadas o insertos transwell (tamaño de poro de 8 micras) con LL-37 a 1 a 10 micromolar en la cámara inferior y monocitos, neutrófilos o células T en la cámara superior. La migración se evalúa después de 2 a 4 horas. Para estudios de células dendríticas, las células dendríticas derivadas de monocitos se generan mediante diferenciación estándar con GM-CSF e IL-4 y luego se exponen a LL-37 a 5 a 20 micromolar durante la estimulación con lipopolisacárido para estudiar sus efectos sobre la maduración de las células dendríticas y la producción de citocinas. Para los estudios de complejos LL-37-ADN propio relevantes para la investigación de la psoriasis, LL-37 a 10 a 40 micromolar se complexa con ADN genómico humano u oligonucleótidos CpG en una proporción de masa péptido a ADN de 1:1 a 10:1, y los complejos se aplican a células dendríticas plasmacitoides para medir la producción de interferón tipo I por ELISA.

Ensayos de cicatrización

Para la investigación de cicatrización de heridas in vitro, los ensayos de migración de queratinocitos (ensayo de herida por rasguño) usan LL-37 a 1 a 20 micromolar aplicado a monocapas confluentes de queratinocitos HaCaT tras crear un rasguño definido con la punta de una pipeta. El cierre de la herida se monitoriza mediante microscopía de lapso de tiempo durante 24 a 48 horas. Los ensayos de formación de tubos endoteliales usan LL-37 a 1 a 10 micromolar aplicado a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) sembradas en pocillos recubiertos con Matrigel, cuantificando la formación de la red de tubos después de 6 a 18 horas. Para estudios de transactivación de EGFR, los queratinocitos o células epiteliales se tratan con LL-37 a 5 a 20 micromolar, y la fosforilación de EGFR se evalúa mediante western blot en los puntos temporales de 5, 15, 30 y 60 minutos.

Modelos in vivo y administración

Para la investigación in vivo en modelos animales, la dosificación de LL-37 varía según la vía de administración y el objetivo de la investigación. En modelos murinos de cicatrización de heridas, LL-37 se aplica tópicamente a 50 a 200 mcg por herida en un vehículo de gel o solución, aplicado una o dos veces al día. En modelos de infección sistémica, LL-37 se administra por vía intraperitoneal a dosis de 2 a 10 mg por kg de peso corporal. En modelos murinos de sepsis, LL-37 a 4 mg por kg por vía intraperitoneal ha demostrado efectos protectores cuando se administra de forma concurrente con el desafío bacteriano. Para la administración intratraqueal en modelos de neumonía, LL-37 a 25 a 100 mcg por ratón se administra en 50 microlitros de solución salina. Es importante señalar que LL-37 es un péptido específico de humanos y el homólogo murino es CRAMP (péptido antimicrobiano relacionado con catelicidina, mCRAMP). Algunos investigadores usan CRAMP en modelos de ratón por relevancia fisiológica, mientras que otros usan LL-37 humano para evaluar el potencial terapéutico del péptido humano específico.

La selección de la vía de administración para la investigación con LL-37 depende del tejido diana. La aplicación tópica es la más práctica para infecciones cutáneas, corneales y mucosas, y es la vía utilizada en los programas de desarrollo clínico. Las formulaciones de LL-37 para uso tópico incluyen soluciones acuosas, preparaciones de hidrogel (con bases de carbómero o ácido hialurónico) y formulaciones basadas en lípidos. La administración intranasal se ha estudiado para aplicaciones en infecciones respiratorias, con soluciones nebulizadas de LL-37 a 50 a 250 mcg por mL que demuestran actividad antimicrobiana en modelos de vías respiratorias. Las vías de inyección subcutánea e intraperitoneal se utilizan para la administración sistémica en modelos animales. La administración intravenosa es teóricamente posible, pero está limitada por la degradación rápida por proteasas séricas y la potencial actividad hemolítica a altas concentraciones.

Almacenamiento y control de calidad

Los protocolos de almacenamiento para LL-37 son críticos para mantener la integridad del péptido. El LL-37 liofilizado debe almacenarse a menos 20 grados Celsius (estable durante al menos 24 meses) o menos 80 grados Celsius (estable durante al menos 36 meses). Proteger de la luz y la humedad. Las soluciones madre de LL-37 reconstituidas deben almacenarse a menos 20 grados Celsius en alícuotas de un solo uso para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. A 2 a 8 grados Celsius, las soluciones reconstituidas mantienen la estabilidad durante aproximadamente 1 a 2 semanas. Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación (más de 3), ya que esto puede provocar agregación del péptido y pérdida de actividad. Para el almacenamiento a corto plazo durante los experimentos, mantenga las soluciones en hielo. LL-37 es susceptible a la oxidación (particularmente en el residuo de metionina si está presente en análogos) y a la degradación proteolítica. Incluya inhibidores de proteasas en las muestras biológicas destinadas a la cuantificación de LL-37. Para el almacenamiento a largo plazo de soluciones madre, añadir 10 por ciento de DMSO puede mejorar la estabilidad, pero el DMSO debe diluirse por debajo del 0,1 por ciento en las soluciones de trabajo para evitar citotoxicidad.

El control de calidad para LL-37 de grado investigación debe verificar los siguientes parámetros. Confirmación de identidad por espectrometría de masas con el peso molecular esperado de 4.493,33 daltons (monoisotópico) o aproximadamente 4.496 daltons (masa promedio). Pureza por HPLC superior al 95 por ciento. Contenido de endotoxinas por debajo de 0,1 EU por mg mediante ensayo LAL (crítico para la investigación inmunológica, ya que la contaminación por LPS confunde todos los estudios de inmunidad innata). Contenido de péptido por análisis de aminoácidos. Contenido neto de péptido del péptido liofilizado (teniendo en cuenta contraiones y humedad; típicamente 70 a 85 por ciento del peso total). Confirmación de la secuencia correcta mediante espectrometría de masas en tándem o degradación de Edman.

Consideraciones de seguridad

Las consideraciones de seguridad para la investigación con LL-37 incluyen lo siguiente. LL-37 es citotóxico para células de mamífero a altas concentraciones (típicamente por encima de 50 micromolar para la mayoría de tipos celulares), por lo que las concentraciones de trabajo deben titularse cuidadosamente. El índice terapéutico (relación entre la concentración citotóxica y la concentración antimicrobiana) varía según el tipo celular y debe establecerse para cada sistema experimental. Para la investigación in vivo, dosis sistémicas altas de LL-37 pueden causar hemólisis y toxicidad renal; la dosificación debe seguir protocolos preclínicos establecidos con la monitorización adecuada. Los investigadores con psoriasis o rosácea deben tener en cuenta que LL-37 está implicado en estas afecciones y deben usar equipo de protección personal apropiado durante la manipulación.

Vitamina D y controles

Para los investigadores interesados en la inducción de LL-37 mediada por vitamina D como alternativa a la administración exógena del péptido, el protocolo estándar consiste en tratar monocitos, macrófagos o células epiteliales con 1,25-dihidroxivitamina D3 a concentraciones de 10 a 100 nanomolar durante 24 a 48 horas, seguido de la cuantificación del ARNm de LL-37 por RT-qPCR y de la proteína por ELISA o western blot. Este enfoque estudia la regulación fisiológica de la producción endógena de LL-37 y es relevante para las estrategias de suplementación con vitamina D para la prevención de infecciones.

Los controles comunes para los experimentos con LL-37 incluyen LL-37 aleatorizado (sLL-37, un péptido con la misma composición de aminoácidos pero secuencia aleatorizada) como control de especificidad de secuencia, LL-37 desnaturalizado por calor (hervido durante 10 minutos) como control estructural, y polimixina B o colistina como controles positivos de actividad antimicrobiana dirigida a membrana. Para los experimentos inmunomoduladores, incluya lipopolisacárido como control positivo de activación de la inmunidad innata y ligandos sintéticos de TLR (CpG para TLR9, imiquimod para TLR7) como controles de las vías de detección de ácidos nucleicos.

En resumen, LL-37 es una herramienta de investigación versátil con aplicaciones que abarcan pruebas antimicrobianas, inmunología, cicatrización de heridas y biología del cáncer. El éxito en la investigación con LL-37 requiere atención a la calidad del péptido, un manejo adecuado para minimizar la adsorción y la degradación, condiciones de ensayo apropiadas que tengan en cuenta la sensibilidad a sales y suero, y controles rigurosos para distinguir los efectos específicos de LL-37 de las actividades inespecíficas de péptidos catiónicos.