Resumen
Una guía práctica para investigadores que trabajan con humanin y su potente análogo HNG (S14G-humanin), que cubre reconstitución, estrategias de dosificación, requisitos de almacenamiento, selección de análogos y consideraciones de seguridad.
La investigación con humanin requiere una atención cuidadosa al manejo y almacenamiento debido a la inestabilidad inherente del péptido y su corta vida media circulante. Esta guía proporciona recomendaciones prácticas para investigadores que trabajan con humanin nativo y sus análogos, particularmente HNG (S14G-humanin), que ofrece una potencia sustancialmente mejorada y es la forma preferida para la mayoría de las aplicaciones experimentales.
El humanin se suministra como polvo liofilizado, típicamente en cantidades de 1 mg o 5 mg por vial. El polvo debe almacenarse a menos 20 grados Celsius inmediatamente al recibirlo para estabilidad a largo plazo. El humanin nativo contiene un residuo de metionina en la posición 1, que es susceptible a la oxidación, haciendo que el almacenamiento y manejo correctos sean críticos para mantener la actividad biológica. Proteja el polvo liofilizado de la luz y la humedad. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento a menos 20 grados Celsius, el péptido liofilizado mantiene estabilidad durante aproximadamente 12 meses.
Para la reconstitución, use agua estéril o solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico (7,2 a 7,4). El humanin es soluble en soluciones acuosas a concentraciones típicamente utilizadas en investigación (rango micromolar). Para reconstituir, agregue el solvente lentamente a lo largo de la pared interior del vial, permita que moje el polvo y gire suavemente hasta disolver. No usar vórtex ni agitar vigorosamente, ya que esto puede causar agregación y pérdida de actividad. La solución reconstituida debe ser clara. Para almacenamiento extendido del péptido reconstituido, alicuotar en porciones de un solo uso en tubos de baja unión de proteínas y congelar a menos 20 grados Celsius. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
La selección entre humanin nativo y el análogo HNG es una decisión temprana importante en el diseño experimental. HNG (S14G-humanin) lleva una única sustitución de aminoácido de serina por glicina en la posición 14 que confiere aproximadamente 1000 veces mayor potencia que el péptido nativo. Esto significa que las concentraciones efectivas de HNG están en el rango nanomolar en lugar del rango micromolar requerido para el humanin nativo, reduciendo significativamente los costos de material. Para la mayoría de las aplicaciones de investigación, se recomienda HNG a menos que el objetivo específico requiera la secuencia nativa.
La dosificación en experimentos de cultivo celular típicamente varía de 0,01 a 1 micromolar para humanin nativo con duraciones de tratamiento de 24 horas siendo estándar para ensayos de citoprotección. Para HNG, las concentraciones efectivas son de 0,01 a 1 nanomolar. En experimentos de neuroprotección, las células se pretrataron típicamente con humanin durante 2 a 4 horas antes de la exposición al estímulo citotóxico. Los efectos protectores del humanin son evidentes dentro de las 4 a 6 horas de tratamiento y persisten hasta 48 horas en sistemas de cultivo.
El almacenamiento de soluciones de humanin reconstituidas a 2 a 8 grados Celsius debe limitarse a no más de 7 días debido al residuo de metionina susceptible a oxidación. Los controles experimentales y la validación son críticos en la investigación con humanin. Incluya controles de vehículo apropiados y, cuando sea posible, un control de péptido codificado con la misma composición de aminoácidos pero secuencia aleatoria para confirmar la especificidad de los efectos.
