Аннотация
Практическое руководство по исследованиям SS-31 (elamipretide), охватывающее реконституцию, протоколы дозирования для доклинических и клинических исследований, требования к хранению, техники введения, стратегии комбинирования и мониторинг безопасности.
SS-31 — уникальное исследовательское соединение, требующее тщательного обращения для сохранения митохондрально-таргетирующих свойств. Данное руководство охватывает практические аспекты работы с SS-31 (elamipretide) в доклинических и клинических исследовательских условиях, включая подготовку, введение, дозирование, хранение и соображения по дизайну экспериментов.
SS-31 поставляется в виде лиофилизированного порошка или, в некоторых препаратах, в виде готового к использованию раствора для инъекций. Лиофилизированная форма должна быть белым или почти белым порошком. Хранить при минус 20 градусах Цельсия для долгосрочной стабильности, где препарат сохраняет активность в течение 12–24 месяцев при соответствующих условиях. D-аминокислота (D-аргинин) на N-конце и амидирование C-конца обеспечивают повышенную устойчивость к ферментативной деградации по сравнению с природными L-аминокислотными пептидами. Остаток диметилтирозина является наиболее химически чувствительным компонентом и должен быть защищён от длительного воздействия света.
Для реконституции лиофилизированного SS-31 используйте стерильную воду, бактериостатическую воду (0,9% бензиловый спирт) или стерильный физиологический раствор в зависимости от предполагаемого применения. Медленно добавляйте растворитель вдоль внутренней стенки флакона и давайте порошку растворяться постепенно. Допустимо осторожное перемешивание круговыми движениями, но избегайте энергичного встряхивания, которое может вызвать пенообразование. Реконституированный раствор должен быть прозрачным и бесцветным или слегка желтоватым. Для флакона 5 мг реконституция с 1 мл растворителя даёт концентрацию 5 мг/мл.
Хранить реконституированный SS-31 при 2–8 градусах Цельсия и использовать в течение 14–21 дней при реконституции с бактериостатической водой или в течение 24 часов при реконституции со стерильной водой без консерванта. Для длительного хранения реконституированного пептида готовьте аликвоты и замораживайте при минус 20 градусах Цельсия. Минимизируйте циклы замораживания-оттаивания до не более двух-трёх.
Доклиническое дозирование на мышиных моделях обычно составляет 3–10 мг/кг/день, вводимых внутрибрюшинно. Наиболее часто используемая дозировка в опубликованных исследованиях — 5 мг/кг/день. Продолжительность лечения варьирует от острых однодозовых исследований до хронических протоколов длительностью 8–12 недель. Для исследований сердечного старения 8-недельных периодов лечения было достаточно для демонстрации улучшений диастолической функции. Для острых моделей ишемии-реперфузии стандартны однократные предварительные дозы или короткие курсы 4–7 дней.
Клиническое дозирование, установленное в ходе фаз 2 и 3, использует подкожную инъекцию 0,25 мг/кг/день, что соответствует примерно 15–20 мг/день для взрослого весом 70 кг. Также оценивались более высокие клинические дозы 40 мг/день.
Техника введения при подкожной инъекции соответствует стандартной практике. Предпочтительные места инъекций включают живот (избегая радиуса 5 см вокруг пупка), переднюю поверхность бедра и заднюю поверхность плеча. Чередуйте места инъекций при каждом введении. Используйте инсулиновые шприцы с иглами 27–31 калибра. Вводите иглу под углом 45–90 градусов в зависимости от глубины подкожной клетчатки, медленно вводите раствор в течение 5–10 секунд и удерживайте иглу на месте 5 секунд перед извлечением.
Для экспериментов с клеточными культурами SS-31 обычно используется в концентрациях от наномолярных до низких микромолярных. Конкретная концентрация зависит от типа клеток и анализа, но 0,1–10 мкмоль охватывает большинство применений.
Ключевые экспериментальные показатели для исследований SS-31 включают потенциал митохондриальной мембраны, измеряемый флуоресцентными красителями JC-1, TMRE или TMRM; производство ATP с использованием анализов на основе люциферазы; генерацию активных форм кислорода с использованием MitoSOX Red; скорость потребления кислорода с использованием анализатора Seahorse XF; содержание и статус окисления кардиолипина. Для кардиальных исследований in vivo золотым стандартом являются эхокардиография для систолической и диастолической функции, 31P-МР-спектроскопия для энергетики миокарда и инвазивная гемодинамика с помощью анализа петли давление-объём.
Комбинированные исследования с предшественниками NAD+ требуют тщательного дизайна эксперимента. При комбинировании SS-31 с NMN на моделях старых животных необходимы независимые группы лечения (только SS-31, только NMN, комбинация и транспортное средство) для количественной оценки аддитивных и синергических эффектов.
Мониторинг безопасности в доклинических исследованиях должен включать ежедневный контроль массы тела, потребления пищи и воды, оценку мест инъекций и периодический забор крови для гематологии и клинической химии.
