LL-37: практическое руководство

LL-37, человеческий антимикробный пептид кателицидинового ряда, представляет собой катионный пептид из 37 аминокислот с широким спектром применения в антимикробных исследованиях, иммунологии, изучении заживления ран и биологии рака. Это руководство содержит практические протоколы для исследовательского использования, опирающиеся на устоявшиеся методологии сообщества исследователей антимикробных пептидов.

Источники и подготовка

LL-37 поставляется в виде синтетического лиофилизированного пептида с последовательностью LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES и молекулярной массой 4493,33 дальтона. LL-37 исследовательского класса доступен от специализированных компаний по синтезу пептидов с чистотой 95% и выше по данным ВЭЖХ, обычно в количествах 1 мг, 5 мг или 10 мг на флакон. Пептид может поставляться в виде трифторацетатной (ТФУ) соли или ацетатной соли. Для клеточных и in vivo исследований предпочтительна ацетатная соль, поскольку ТФУ может вызывать цитотоксичность при более высоких концентрациях пептида. Если доступен только пептид в форме ТФУ-соли, ТФУ можно удалить путём повторной лиофилизации из разбавленной соляной кислоты (0,1 М HCl) или с помощью анионного обмена.

Для восстановления лиофилизированного LL-37 дайте флакону нагреться до комнатной температуры в течение 15–20 минут. LL-37 растворим в воде, физиологическом растворе и буферных растворах, однако его растворимость и биологическая активность зависят от pH и ионной силы. Для приготовления исходного раствора растворите LL-37 в стерильной, свободной от эндотоксинов воде до концентрации 1–5 мг/мл (приблизительно 220–1110 микромоль). При таких концентрациях LL-37 может самоассоциироваться в олигомерные структуры, что является нормой и не свидетельствует о деградации. Для рабочих растворов в антимикробных анализах разведите исходный раствор в соответствующем буфере или среде для анализа. Важно: LL-37 легко адсорбируется на пластиковых и стеклянных поверхностях, особенно при низких концентрациях. Чтобы минимизировать потери на адсорбцию, используйте пробирки с низким связыванием белка (полипропиленовые или силиконизированные), готовьте рабочие растворы с концентрацией выше 1 микромоль, когда это возможно, и добавляйте белок-носитель (0,01% бычий сывороточный альбумин) в очень разбавленные растворы. Для инъекционного применения растворяйте в стерильной бактериостатической воде или стерильном физиологическом растворе. Восстановленный раствор должен быть прозрачным. Лёгкая опалесценция при высоких концентрациях — норма, отражающая олигомерную ассоциацию.

Протоколы дозирования для исследований LL-37 существенно различаются в зависимости от применения и модельной системы. В следующих разделах описаны устоявшиеся протоколы для основных категорий исследований.

Антимикробные и противобиоплёночные тесты

Для антимикробного тестирования in vitro стандартная методология следует руководствам Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) по тестированию антимикробной чувствительности, адаптированным для пептидных агентов. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) проводится методом серийных разведений в бульоне в 96-луночных полипропиленовых планшетах (не полистироле, который адсорбирует катионные пептиды). Стандартной средой служит бульон Мюллера-Хинтон, но следует учитывать, что содержание в нём двухвалентных катионов влияет на активность LL-37. Некоторые исследователи используют бульон Мюллера-Хинтон со скорректированным содержанием катионов (CAMHB) для стандартизации. LL-37 тестируется в двукратных серийных разведениях от 128 мкг/мл до 0,25 мкг/мл. Типичные значения МИК для LL-37 в отношении распространённых патогенов таковы: Escherichia coli — 2–16 мкг/мл; Staphylococcus aureus — 16–64 мкг/мл; Pseudomonas aeruginosa — 16–64 мкг/мл; Candida albicans — 8–32 мкг/мл. Для анализов время-уничтожение бактерии в середине логарифмической фазы роста (приблизительно 10^6 колониеобразующих единиц на мл) подвергают воздействию LL-37 в концентрациях 1×, 2× и 4× МИК, с отбором проб на 0, 15, 30, 60, 120 и 240 минутах для определения количества жизнеспособных клеток.

Для исследований противобиоплёночной активности LL-37 особенно примечателен тем, что подавляет формирование биоплёнок при суб-МИК концентрациях. В анализах предотвращения образования биоплёнок LL-37 используется в концентрациях 0,5–16 мкг/мл, добавляемых в момент инокуляции бактерий в 96-луночных планшетах. Массу биоплёнки количественно оценивают через 24 часа окрашиванием кристаллическим фиолетовым. Для разрушения уже сформированных биоплёнок зрелые биоплёнки возрастом 24–48 часов обрабатывают LL-37 в концентрациях 32–256 мкг/мл (2×–16× МИК) в течение 24 часов, при этом жизнеспособность биоплёнки оценивают окрашиванием LIVE/DEAD с конфокальной микроскопией или подсчётом колоний диспергированных бактерий биоплёнки.

Иммуномодуляторные клеточные тесты

Для иммуномодуляторных исследований в клеточной культуре LL-37 используется в концентрациях 1–50 микромоль (приблизительно 4,5–225 мкг/мл) для изучения его воздействия на иммунные клетки. Анализы хемотаксиса проводятся с использованием модифицированных камер Бойдена или трансвелл-вставок (размер пор 8 микрон) с LL-37 в концентрации 1–10 микромоль в нижней камере и моноцитами, нейтрофилами или Т-клетками в верхней камере. Миграцию оценивают через 2–4 часа. В исследованиях дендритных клеток моноцит-производные дендритные клетки получают стандартной дифференцировкой с GM-CSF и IL-4, а затем подвергают воздействию LL-37 в концентрации 5–20 микромоль во время стимуляции липополисахаридом для изучения его влияния на созревание дендритных клеток и продукцию цитокинов. Для исследований комплексов LL-37 с собственной ДНК, актуальных для изучения псориаза, LL-37 в концентрации 10–40 микромоль комплексуют с геномной ДНК человека или CpG-олигонуклеотидами в массовом соотношении пептид:ДНК от 1:1 до 10:1, и полученные комплексы применяют к плазмоцитоидным дендритным клеткам для измерения продукции интерферона I типа методом ИФА.

Тесты заживления ран

Для исследований заживления ран in vitro в анализах миграции кератиноцитов (тест «царапины») используют LL-37 в концентрации 1–20 микромоль, применяемый к конфлюэнтным монослоям кератиноцитов HaCaT после нанесения определённой царапины наконечником пипетки. Закрытие раны отслеживают методом покадровой микроскопии в течение 24–48 часов. В анализах формирования эндотелиальных трубок используют LL-37 в концентрации 1–10 микромоль, применяемый к эндотелиальным клеткам пупочной вены человека (HUVEC), высеянным на лунки, покрытые Матригелем, с количественной оценкой формирования сети трубок через 6–18 часов. Для исследований трансактивации EGFR кератиноциты или эпителиальные клетки обрабатывают LL-37 в концентрации 5–20 микромоль, а фосфорилирование EGFR оценивают методом вестерн-блоттинга во временных точках 5, 15, 30 и 60 минут.

Модели in vivo и введение

Для исследований in vivo на животных моделях дозирование LL-37 варьируется в зависимости от пути введения и цели исследования. В мышиных моделях заживления ран LL-37 применяют местно в дозе 50–200 мкг на рану в геле или растворе-носителе, один или два раза в день. В моделях системной инфекции LL-37 вводят внутрибрюшинно в дозах 2–10 мг/кг массы тела. В мышиных моделях сепсиса LL-37 в дозе 4 мг/кг внутрибрюшинно продемонстрировал защитный эффект при введении одновременно с бактериальным заражением. Для интратрахеального введения в моделях пневмонии LL-37 в дозе 25–100 мкг на мышь вводят в 50 мкл физиологического раствора. Важно отметить, что LL-37 — видоспецифичный для человека пептид, а мышиным гомологом является CRAMP (кателицидин-родственный антимикробный пептид, mCRAMP). Некоторые исследователи используют CRAMP в мышиных моделях для физиологической релевантности, тогда как другие используют человеческий LL-37 для оценки терапевтического потенциала именно этого пептида.

Выбор пути введения для исследований LL-37 зависит от целевой ткани. Местное применение наиболее практично для инфекций кожи, роговицы и слизистых оболочек и представляет собой путь, используемый в программах клинической разработки. Формы LL-37 для местного применения включают водные растворы, гидрогелевые препараты (на основе карбомера или гиалуроновой кислоты) и липидные составы. Интраназальное введение изучалось для применений при респираторных инфекциях, при этом небулизированные растворы LL-37 в концентрациях 50–250 мкг/мл продемонстрировали антимикробную активность в моделях дыхательных путей. Подкожный и внутрибрюшинный пути инъекции используются для системного введения в моделях на животных. Внутривенное введение теоретически возможно, но ограничено быстрой деградацией сывороточными протеазами и потенциальной гемолитической активностью при высоких концентрациях.

Хранение и контроль качества

Протоколы хранения LL-37 критически важны для сохранения целостности пептида. Лиофилизированный LL-37 следует хранить при минус 20 °C (стабилен не менее 24 месяцев) или минус 80 °C (стабилен не менее 36 месяцев). Защищать от света и влаги. Восстановленные исходные растворы LL-37 следует хранить при минус 20 °C в аликвотах разового использования, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. При 2–8 °C восстановленные растворы сохраняют стабильность в течение приблизительно 1–2 недель. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания (более 3 раз), поскольку это может привести к агрегации пептида и потере активности. Для кратковременного хранения во время экспериментов держите растворы на льду. LL-37 подвержен окислению (особенно по остатку метионина, если он присутствует в аналогах) и протеолитической деградации. Включайте ингибиторы протеаз в биологические образцы, предназначенные для количественного определения LL-37. Для длительного хранения исходных растворов добавление 10% ДМСО может улучшить стабильность, но ДМСО необходимо разбавить до концентрации ниже 0,1% в рабочих растворах во избежание цитотоксичности.

Контроль качества исследовательского LL-37 должен подтверждать следующие параметры. Подтверждение идентичности методом масс-спектрометрии с ожидаемой молекулярной массой 4493,33 дальтона (моноизотопная) или приблизительно 4496 дальтон (средняя масса). Чистота по ВЭЖХ более 95%. Содержание эндотоксинов ниже 0,1 ЕЭ/мг по LAL-тесту (критично для иммунологических исследований, поскольку загрязнение ЛПС искажает результаты всех исследований врождённого иммунитета). Содержание пептида по данным аминокислотного анализа. Чистое содержание пептида в лиофилизате (с учётом противоионов и влаги; обычно 70–85% от общей массы). Подтверждение правильности последовательности методом тандемной масс-спектрометрии или деградации по Эдману.

Соображения безопасности

К вопросам безопасности при работе с LL-37 относится следующее. LL-37 цитотоксичен для клеток млекопитающих при высоких концентрациях (обычно выше 50 микромоль для большинства типов клеток), поэтому рабочие концентрации следует тщательно подбирать. Терапевтический индекс (отношение цитотоксической концентрации к антимикробной) варьируется в зависимости от типа клеток и должен устанавливаться для каждой экспериментальной системы отдельно. Для исследований in vivo высокие системные дозы LL-37 могут вызывать гемолиз и почечную токсичность; дозирование должно следовать установленным доклиническим протоколам с надлежащим мониторингом. Исследователям с псориазом или розацеа следует учитывать, что LL-37 причастен к этим состояниям, и использовать соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с пептидом.

Индукция витамином D и контроли

Для исследователей, заинтересованных в опосредованной витамином D индукции LL-37 как альтернативе экзогенному введению пептида, стандартный протокол предполагает обработку моноцитов, макрофагов или эпителиальных клеток 1,25-дигидроксивитамином D3 в концентрациях 10–100 наномоль в течение 24–48 часов с последующим количественным определением мРНК LL-37 методом ОТ-ПЦР в реальном времени и белка методом ИФА или вестерн-блоттинга. Такой подход позволяет изучать физиологическую регуляцию продукции эндогенного LL-37 и актуален для стратегий применения витамина D для профилактики инфекций.

Распространённые контроли для экспериментов с LL-37 включают скрамблированный LL-37 (sLL-37, пептид с тем же аминокислотным составом, но рандомизированной последовательностью) в качестве контроля специфичности последовательности, термически денатурированный LL-37 (кипячение в течение 10 минут) в качестве структурного контроля, а также полимиксин B или колистин в качестве положительных контролей мембрано-таргетной антимикробной активности. Для иммуномодуляторных экспериментов включайте липополисахарид в качестве положительного контроля активации врождённого иммунитета и синтетические лиганды TLR (CpG для TLR9, имиквимод для TLR7) в качестве контролей путей распознавания нуклеиновых кислот.

В заключение, LL-37 представляет собой универсальный исследовательский инструмент с применениями, охватывающими антимикробное тестирование, иммунологию, заживление ран и биологию рака. Успех в исследованиях LL-37 требует внимания к качеству пептида, надлежащего обращения для минимизации адсорбции и деградации, подходящих условий анализа, учитывающих чувствительность к солям и сыворотке, а также строгих контролей для отделения специфических эффектов LL-37 от неспецифической активности катионных пептидов.