Humanin: Практическое руководство по исследованиям и применению

Исследование humanin требует тщательного внимания к обращению и хранению в связи с нестабильностью пептида и коротким периодом полувыведения из циркуляции. Данное руководство содержит практические рекомендации для исследователей, работающих с нативным humanin и его аналогами, прежде всего HNG (S14G-humanin), обеспечивающим существенно более высокую эффективность и являющимся предпочтительной формой для большинства экспериментальных применений. Humanin поставляется в виде лиофилизированного порошка, как правило, в количестве 1 мг или 5 мг на флакон. Порошок следует немедленно при получении хранить при минус 20 градусах Цельсия для долгосрочной стабильности. Нативный humanin содержит остаток метионина в позиции 1, подверженный окислению, что делает правильное хранение и обращение критически важными для поддержания биологической активности. Защищайте лиофилизированный порошок от света и влаги. При оптимальных условиях хранения при минус 20 градусах Цельсия лиофилизированный пептид сохраняет стабильность около 12 месяцев. При минус 80 градусах Цельсия стабильность повышается, но для большинства исследовательских задач это не требуется. Для восстановления используйте стерильную воду или фосфатно-солевой буфер при физиологическом pH (7,2–7,4). Humanin растворим в водных растворах при концентрациях, обычно используемых в исследованиях (микромолярный диапазон). Для восстановления медленно добавьте растворитель вдоль внутренней стенки флакона, дайте ему смочить порошок и осторожно вращайте до растворения. Не вортексировать и не встряхивать интенсивно — это может вызвать агрегацию и снижение активности. Восстановленный раствор должен быть прозрачным. Любая мутность или осадок могут свидетельствовать о неправильном растворении или деградации. Для длительного хранения восстановленного пептида аликвотируйте в одноразовые части в пробирках с низким связыванием белка и замораживайте при минус 20 градусах Цельсия. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания, ускоряющих деградацию метионинового остатка. Выбор между нативным humanin и аналогом HNG является важным ранним решением в экспериментальном дизайне. HNG (S14G-humanin) несёт одиночную аминокислотную замену серина на глицин в позиции 14, что обеспечивает примерно в 1000 раз бо́льшую эффективность, чем нативный пептид. Это означает, что эффективные концентрации HNG находятся в наномолярном, а не микромолярном диапазоне, необходимом для нативного humanin, что существенно снижает материальные затраты и позволяет использовать меньшие объёмы инъекций в исследованиях на животных. Для большинства исследовательских применений рекомендуется HNG, если только конкретная задача не требует нативной последовательности. Дозирование в экспериментах с клеточными культурами обычно варьируется от 0,01 до 1 микромоля для нативного humanin при стандартной длительности лечения 24 часа для анализов цитопротекции. Для HNG эффективные концентрации составляют 0,01–1 наномоля. В экспериментах по нейропротекции клетки обычно предварительно обрабатывают humanin в течение 2–4 часов перед воздействием цитотоксического стимула или обрабатывают одновременно. Исследования временно́го хода показали, что защитные эффекты humanin проявляются через 4–6 часов лечения и сохраняются до 48 часов в системах клеточных культур. Хранение восстановленных растворов humanin при 2–8 градусах Цельсия следует ограничивать не более чем 7 днями из-за окисляемого метионинового остатка. Для HNG стабильность несколько лучше, но аналогичные меры предосторожности применимы. Добавление антиоксидантов, таких как 0,1% аскорбиновой кислоты, в растворы для восстановления может продлить стабильность, но может вносить мешающие переменные в экспериментах с окислительным стрессом. При приготовлении растворов для инъекций животным используйте стерильный физиологический раствор или PBS в качестве носителя и фильтруйте через стерильные фильтры 0,22 мкм. Экспериментальные контроли и валидация имеют критическое значение в исследованиях humanin. Включайте соответствующие контроли носителя и, по возможности, контроль со скремблированным пептидом для подтверждения специфичности эффектов. Для STAT3-зависимых показателей включайте ингибитор STAT3 в качестве механистического контроля. Измерение эндогенных уровней humanin в экспериментальных системах с помощью специфических ELISA-наборов может помочь интерпретировать результаты. Соображения безопасности для исследователей, работающих с humanin, минимальны: пептид не обладает известной токсичностью при исследовательских концентрациях. Применяются стандартные лабораторные меры безопасности при обращении с пептидами: перчатки, работа в чистых условиях, надлежащая утилизация острых предметов и биоопасных материалов.