Аннотация
Практическое руководство по Dihexa для лабораторных исследований, охватывающее обращение с этим мощным соединением, приготовление растворов для исследований in vitro и in vivo, опубликованные протоколы дозирования из животных исследований и критические соображения безопасности.
Данное руководство предоставляет практическую информацию для исследователей, работающих с Dihexa в лабораторных условиях. Учитывая исключительную эффективность Dihexa и отсутствие данных о безопасности для людей, данная информация направлена исключительно на применение in vitro и в исследованиях на животных. Dihexa не одобрен для применения у людей ни одним регуляторным органом.
Dihexa поставляется в виде белого или почти белого лиофилизированного порошка, как правило, в исследовательских количествах 5 мг, 10 мг или 50 мг. Соединение стабильно в лиофилизированной форме при надлежащем хранении. Его небольшая молекулярная масса (приблизительно 407 дальтон) и разработанная метаболическая стабильность делают его подходящим для различных экспериментальных парадигм, включая исследования клеточных культур in vitro, препараты тканей ex vivo и исследования на животных in vivo.
Для исследований in vitro Dihexa обычно растворяют в диметилсульфоксиде (DMSO) для приготовления концентрированных маточных растворов. Общепринятый подход — приготовить 10 мМ маточный раствор в DMSO, который затем разбавляют питательной средой до желаемой экспериментальной концентрации. Учитывая диапазон активности Dihexa от пикомолярных до наномолярных концентраций, необходимы серийные разведения из маточного раствора. Готовьте маточные растворы в стерильных условиях и аликвотируйте в малые объёмы для минимизации циклов заморозки-оттаивания. Концентрация DMSO в конечной культуральной среде не должна превышать 0,1 процента, чтобы избежать клеточных эффектов растворителя.
Эффективный диапазон концентраций для исследований in vitro охватывает от пикомолярных до низких наномолярных концентраций. Опубликованные исследования показали значительные эффекты на рост нейритов, формирование дендритных шипиков и сигнализацию HGF/c-Met при концентрациях от 10 до 100 пикомоль. Эксперименты по зависимости доза-ответ должны охватывать широкий диапазон концентраций (от 1 пМ до 1 мкМ) для полной характеристики кривой активности, поскольку для некоторых конечных точек были выявлены колоколообразные кривые доза-ответ.
Для исследований in vivo на животных Dihexa вводился несколькими путями в опубликованных исследованиях. Интрацеребровентрикулярное (ИЦВ) введение крысам показало когнитивные эффекты при дозах от 0,01 до 1 наномоля на инъекцию. Протоколы подкожной инъекции использовали дозы в диапазоне 0,1–2 мг на кг массы тела. Пероральное введение — наиболее практически релевантный путь — показало эффективность приблизительно при 1–2 мг на кг у крыс.
Для орального зондирования у грызунов Dihexa можно растворять в растворах-носителях, включая физиологический раствор 0,9%, фосфатно-солевой буфер или 5% DMSO в физиологическом растворе. Раствор следует готовить свежим для каждого эксперимента или хранить при минус 20 градусах Цельсия в течение коротких периодов. Пероральная биодоступность Dihexa у грызунов, по-видимому, достаточна для активности в ЦНС при описанных дозах, хотя точные данные по биодоступности не были полностью опубликованы.
Для подкожных инъекций у грызунов Dihexa растворяют в стерильном физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере. Растворы следует стерильно фильтровать через шприцевые фильтры 0,22 мкм перед инъекцией. Стандартные места подкожной инъекции у грызунов включают кожную складку между лопатками (загривок) или боковую поверхность туловища.
Меры предосторожности при обращении с Dihexa отражают как его эффективность, так и неопределённость его профиля безопасности для людей. Хотя Dihexa не классифицируется как остро опасный, его исключительная биологическая эффективность требует тщательного обращения для минимизации непреднамеренного воздействия. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая нитриловые перчатки, лабораторный халат и защиту глаз при работе с порошком или растворами. Работайте с порошком в вытяжном шкафу или боксе биологической безопасности, чтобы предотвратить вдыхание мелких частиц. Немедленно очищайте любые разливы подходящими растворителями и одноразовыми абсорбирующими материалами.
Хранение лиофилизированного Dihexa должно осуществляться при минус 20 градусах Цельсия в запечатанном контейнере, защищённом от света и влаги, где стабильность поддерживается длительное время. Маточные растворы DMSO следует аликвотировать и хранить при минус 20 градусах Цельсия, избегая повторных циклов заморозки-оттаивания. Водные растворы следует готовить свежими или хранить при 2–8 градусах Цельсия и использовать в течение 24–48 часов, поскольку данные об устойчивости в водной среде ограничены.
Протоколы поведенческого тестирования, используемые в опубликованных исследованиях Dihexa, включают водный лабиринт Морриса (пространственное обучение и память), распознавание новых объектов (распознавательная память), радиальный лабиринт с рычагами (рабочая память) и пассивное избегание (контекстуальная память страха). В моделях когнитивного нарушения наиболее широко применяются скополамин-индуцированный холинергический дефицит и возрастное когнитивное снижение. Лечение обычно вводится за 30–60 минут до поведенческого тестирования для острых исследований или ежедневно в течение 7–14 дней для хронических исследований с тестированием в конце периода лечения.
Аналитические методы количественного определения Dihexa в биологических образцах включают жидкостную хроматографию-тандемную масс-спектрометрию (ЖХ-МС/МС), обеспечивающую чувствительность, необходимую для обнаружения низких концентраций, при которых это соединение биологически активно. ВЭЖХ с УФ-детекцией подходит для контроля качества маточных растворов, но может иметь недостаточную чувствительность для фармакокинетических исследований.
Важные ограничения и меры предосторожности для исследований Dihexa: эффекты соединения на сигнализацию HGF/c-Met выходят за пределы ЦНС. Исследователи должны знать, что системное введение Dihexa может активировать сигнализацию c-Met в периферических тканях, включая печень, почки и потенциально в скрытых опухолях. Долгосрочные исследования на животных должны включать гистопатологическое исследование основных органов и оценку на предмет неопластических изменений. Отсутствие опубликованных долгосрочных данных по канцерогенности представляет собой существенный пробел в характеристике безопасности этого соединения.
Этические комитеты и институциональные комитеты по уходу за животными должны быть информированы об уникальном профиле рисков Dihexa при рассмотрении исследовательских протоколов. Теоретические онкологические опасения требуют специального рассмотрения при разработке исследования, включая соответствующие конечные точки мониторинга и гуманные конечные точки, связанные с развитием опухоли.
